乳酸菌檢驗的計數方法與規則詳解

  一、 引言

  前期曾介紹了乳酸菌的分類和乳酸菌檢驗所用的幾種主要培養基，本文將進一步就GB 4789.35中乳酸菌檢驗時所用的計數方法和規則進行詳細解讀。

二、計數方法

  《GB 4789.35 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中，主要涉及了3種乳酸菌，分別為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬。由于3種乳酸菌的培養條件和特征各有不同，要檢驗出樣品中乳酸菌的總數，就需要根據菌種的不同選擇使用合適的培養基，對結果進行計數。標準中是這樣規定的:（表1）

  其中：

  6.2.3.2 是使用改良MRS培養基傾注，厭氧培養，對雙歧桿菌進行計數；

  6.2.3.3 是使用MC培養基傾注，需氧培養，對嗜熱鏈球菌進行計數；

  6.2.3.4 是使用MRS培養基傾注，厭氧培養，對乳桿菌（或乳桿菌與雙歧桿菌）進行計數。

  從表中可以看出，在檢驗乳酸菌數量時，是分了3種情況分別進行規定：

1、單一菌種的情況

  （1）只有雙歧桿菌時，使用MRS培養基或者雙歧桿菌瓊脂傾注、培養、計數；

  （2）只有乳桿菌時，使用MRS培養基進行培養計數；

  （3）只有嗜熱鏈球菌時，使用MC培養基進行培養計數。此處需要說明一下，嗜熱鏈球菌在MRS上也能生長良好（如圖1），所以當只有這種單一菌種存在時，日常工作中，如果不需要完-全按照國標要求，是否可以使用MRS培養基進行培養計數？

圖1 MRS上三種菌的生長情況

  綜合比較，當只有單一菌種存在的情況下，如果不需要嚴格按照國標要求來操作，只需要將樣品稀釋后，取合適濃度用MRS培養基進行傾注計數即可。MRS可以作為通用培養基使用。

2、兩種菌的情況

  如果樣品中有兩種菌存在，除了要檢驗出乳酸菌的總數外，有時還需要對其中各個菌種的數目進行統計。

  （1）含有雙歧桿菌和乳桿菌時，使用MRS培養基對樣品進行傾注后厭氧培養，即可得出兩種乳酸菌的總數；而如果還想知道里面所含雙歧桿菌的數目，則需要同時用改良MRS進行傾注計數，改良MRS上長出的菌落數，即為雙歧桿菌的數目。

  （2）含有雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌時，標準中使用改良MRS和MC進行傾注計數，分別得出雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的數目，兩者加在一起即為菌落總數。采用改良MRS對雙歧桿菌進行計數，這個沒有爭議，因為在改良MRS瓊脂中，只有雙歧桿菌能生長，嗜熱鏈球菌不能生長。

  在MC瓊脂上，雖然在厭氧條件下，嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌都能生長（如圖2），但本標準中要求需氧培養，所以此時MC瓊脂上長出的就只有嗜熱鏈球菌了。這個方法是可以達到計數嗜熱鏈球菌的目的的。

圖2 厭氧培養條件下MC瓊脂上雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的生長狀態

  在日常工作中，如果不嚴格按照國標要求，我們也可以選擇使用MRS瓊脂和改良MRS瓊脂進行傾注培養，MRS平板上所有菌落之和即為菌落總數，改良MRS平板上的菌數即為雙歧桿菌的菌數。

  （3）含有乳桿菌和嗜熱鏈球菌時，標準中采用MRS瓊脂厭氧培養和MC瓊脂需氧培養進行計數，分別得出乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數目，兩者之和算作乳酸菌的總數。

  這一規定的問題在于：因為這兩種菌都能在這兩種培養基上生長良好，即MRS瓊脂上可以長出乳桿菌和嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球菌在MRS培養基上厭氧培養的結果，如圖3），MC瓊脂上也能長出乳桿菌和嗜熱鏈球菌，只是菌落大小的差異。其中在MRS瓊脂上，雖然多數乳桿菌菌落較大，但對于有些乳桿菌（如德氏乳桿菌CICC 6032），菌落直徑也很小，跟嗜熱鏈球菌很容易混淆（如圖3）。

圖3  MRS上德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌落形態

  同樣，兩種菌在MC瓊脂上的菌落形態如下圖（圖4）：

圖4 德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MC培養基上的菌落形態

  所以，要想從同一種培養基上，明顯地區分出兩種菌來，分別計數，確實也不容易。

  問題的關鍵在于，標準中明確規定，將兩種培養基上培養出的菌數，進行相加，即得乳酸菌總數。通過上面的分析，我們不難得出，這樣處理，得出的結果實際上是把乳酸菌總數翻倍了，即乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數目分別重復了兩遍，并且也不能明確得出每種乳酸菌的具體數目。

  綜合以上三種情況，我們可以總結為，在不需要嚴格按照標準操作的前提下，如果已知樣品中有兩種乳酸菌，要檢驗樣品中的乳酸菌總數，只要用MRS進行傾注就可以了，平板上長出的菌數即為乳酸菌總數；而要確切地知道其中某一種菌的數目，則要根據情況進行培養基的選擇：使用改良MRS可以很容易得出雙歧桿菌的數目，使用MC可以勉強計出嗜熱鏈球菌的數目，但要注意避免其他菌種的干擾；對于乳桿菌的數目，只要用菌落總數減去已經計出的另一種菌的數目即可。

3、三種菌的情況

  標準中規定，用MC需氧培養，得出嗜熱鏈球菌的數目；MRS厭氧培養，得出乳酸菌和雙歧桿菌的總數，將兩者加和，即為乳酸菌總數；如果要單獨檢驗雙歧桿菌的數目，則采用改良MRS瓊脂進行厭氧培養后計數可得。

  這里同樣存在上面所述的問題。

  對于標準中為什么這么寫，我們可以理解成，它默認了在MRS瓊脂上嗜熱鏈球菌不會生長，而在MC瓊脂上乳桿菌不會生長？但這明顯是與我們實際操作情況不相符的。

  如果按照這種要求進行計數，終所得的數目，將會把乳桿菌和嗜熱鏈球菌重復計數。

  在日常工作中，如果不需要嚴格按照國標操作，要解決這一問題，我們還是借助這兩種培養基，只要將MRS上長出的所有菌落數出來，即為樣品中的菌落總數。而如果非要追究里面所含嗜熱鏈球菌的數目，只能借助MC瓊脂，計數時要仔細甄別，不要誤將乳桿菌計成了嗜熱鏈球菌，從而導致結果誤差；用菌落總數減去嗜熱鏈球菌的數目，即為乳桿菌的數目。

  這樣一來，我們可以將上面三種情況進行總結，如下表：

表2  乳酸菌計數時培養基的選擇及計數方法表

注：表格中所有使用MC瓊脂的，均采用需氧培養方式；其它培養基均為厭氧培養

  通過表格，我們可以一目了然地對乳酸菌計數中使用的培養基進行選擇：在不需嚴格按照國標要求進行操作的情況下，不管樣品中含有幾種菌，只要求總數，統一用MRS瓊脂即可，MRS瓊脂可以算得上檢驗乳酸菌菌落總數的“培養基"；在多種菌種共存的情況下，要想知道雙歧桿菌的數目，直接選擇改良MRS；對于嗜熱鏈球菌可以通過計算或MC傾注的方式得到，本人建議能計算的情況下，計算方法；而對于乳桿菌的數目，只能采用計算的方法得到，因為GB中并沒有一種特定的培養基，能將乳桿菌與其它種類的乳酸菌區分開來。

三、計數規則

  上面討論的三種乳酸菌的培養計數方法，當選用了合適的方法，培養出菌落后，怎么選擇合適的平板進行計數，也是實驗人員要面臨的問題。

  對于這一點，標準中逐條做出了規定，為了方便大家理解和掌握，筆者特整合成下面的圖示進行說明（圖5），希望能給廣大實驗人員提供幫助。

圖5 菌落計數規則

四、說明

  在樣品（包括食品、藥品、化妝品等）檢驗過程中，檢驗人員應首先參考相應的標準進行各項操作，只要標準沒有錯誤，就應該嚴格按照標準規定的條件和方法來檢驗，這樣才能保證檢驗結果的一致性和可靠性。但是，如果標準中的個別地方出現了明顯的疑義或者有些方法不利于正確結果的判斷，究竟該怎么處理，要具體情況具體分析。

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